鬼筆毒肽(PLD)ELISA試劑盒

簡介
鬼筆毒肽，系從毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中得到的有毒的環狀七肽，為細針狀結晶。往往與鵝膏毒素（amatoxins）一起存在（它們來自同一條合成途徑），毒性比鵝膏蕈堿弱，對小鼠的半致死劑量是50ug/kg，對人體也有很強的毒性，可引起流涎、嘔吐、便血、發紺、痙攣、肌肉攣縮，以致死亡。它同細胞松弛素的作用相反,只與聚合的微絲結合，而不與肌動蛋白單體分子結合。它同聚合的微絲結合后,抑制了微絲的解體，因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態平衡。本酶聯免疫檢測試劑盒可以經濟、快速地檢測飼料等樣品中的鬼筆毒肽的殘留量。
檢測原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中鬼筆毒肽和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭鬼筆毒肽抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。隨后結合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的鬼筆毒肽成負相關。通過標準曲線可準確定量樣品中鬼筆毒肽的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數即為實際樣品中鬼筆毒肽的含量。

需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
鬼筆毒肽(PLD)ELISA試劑盒
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將3000ppb標準品（200µL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至729 ppb（例：243µL的標準品母液+757µL的1×稀釋液，制備得到1000μL的729 ppb濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將729 ppb標準品依次3倍倍比稀釋至7個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：729ppb、243ppb、81ppb、27ppb、9ppb、3ppb、1ppb，從最高濃度標準品溶液中吸取300μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ppb)。



一抗工作液配置
使用十分鐘前，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據所需用量配置。
酶標二抗工作液配置
使用十分鐘前，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據所需用量配置。

備 注：如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數
(建議：將待測樣本用樣品稀釋液低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據實驗所需酶標板孔數吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結果的穩定性）

結果的計算

計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

示例數據

以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。

精密度

批內精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。

批內變異系數 CV%小于10%。

批間精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。
批間變異系數 CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80% - 120%

靈敏度

經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為1 ppb。
線性關系

校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.999。